Microbiología

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Utilidad de la NGS en el diagnóstico y seguimiento de neoplasias mieloides
(2024-07) Quesada Paniagua, Mariel; Santamaría Quesada, Carlos Manuel
Las neoplasias mieloides son un conjunto de enfermedades genéticamente diversas. Su diagnóstico está basado en la identificación de células mieloides malignas por medio de la morfología, inmunohistoquímica y la citometría de flujo. Posterior al diagnóstico, se realiza una subclasificación de la enfermedad con el objetivo de establecer un pronóstico y elegir el tratamiento. En la actualidad, el manejo de la enfermedad involucra distintas disciplinas y técnicas diagnósticas. Las guías internacionales han incorporado distintas alteraciones genéticas para adecuar la terapia según la clasificación diagnóstica y pronóstica. Para su detección, se han utilizado técnicas convencionales que han ido sustituyéndose con el desarrollo de nuevas tecnologías más sensibles como qPCR, dPCR y la NGS. Este documento describe el papel que tiene la NGS en el diagnóstico y seguimiento de las neoplasias mieloides, considerando el manejo actual que representan otras técnicas moleculares
Citometría de flujo de nueva generación y su aplicación en la detección y monitorización de células plasmáticas en el contexto de mieloma múltiple: una revisión del estado actual y los principales avances
(2024) Herrera Valerio, Laura Marcela; Alfaro Gómez, Estiven
El mieloma múltiple (MM) es una de las neoplasias malignas hematológicas más prevalentes causada por la proliferación clonal de células plasmáticas (CP), que se distribuyen predominantemente en la médula ósea gracias a su adhesión al microambiente medular. Sin embargo, en la actualidad hay evidencia de que las CP clonales también pueden pasar a la circulación sanguínea para posteriormente alojarse en tejidos intramedulares o tejidos distantes, lo que permite que circulen y residan en la sangre periférica. (Xia Y, 2023 ) Aunque el estándar de oro para la detección de enfermedad medible residual (EMR) en MM sigue siendo mediante muestras de médula ósea (MO), la detección de células plasmáticas circulantes en sangre periférica por citometría de flujo puede proporcionar una forma menos invasiva, conveniente y un enfoque fiable para la estratificación del riesgo y el seguimiento de la enfermedad. (Xia Y, 2023 ) La EMR se ha convertido en un procedimiento estándar para el seguimiento de muchas neoplasias malignas hematológicas, en el caso del MM la efectividad alcanzada por las terapias actuales ha permitido llegar a una profundidad de respuesta mayor por lo que la EMR se considera una variable importante a considerar. (Bruno Paiva, 2020) En Costa Rica actualmente se realiza citometría de flujo de nueva generación con paneles y procedimientos estandarizados por el Consorcio Europeo EuroFlow con el fin de aportar información al diagnóstico y determinación de EMR en dos hospitales nacionales que corresponden al Hospital Calderón Guardia y el Hospital San Juan de Dios. La técnica de citometría de flujo empleada en el país se realiza utilizando la médula ósea como muestra, los protocolos actuales no incluyen el procesamiento de muestras de sangre periférica ante la sospecha de MM ni en la evaluación de la EMR. Por ello, se expone aquí una propuesta de algoritmo diagnóstico, donde se recomienda la implementación del análisis de citometría de flujo en algunos escenarios clínicos. (Sanoja-Flores, 2020).
El papel del diagnóstico molecular en las hemoglobinopatías y su situación actual en Costa Rica
(2024-07) Sandí Calderón, Gabriela; Suárez Sánchez, María José
El objetivo de esta investigación fue analizar las principales técnicas moleculares utilizadas en el diagnóstico de hemoglobinopatías, su disponibilidad e importancia en Costa Rica. Para ello, se llevó a cabo una revisión bibliográfica que describió las técnicas moleculares empleadas a nivel mundial en el diagnóstico de hemoglobinopatías y se identificaron las que actualmente están disponibles en Costa Rica, tanto en los laboratorios del sector público y como en el sector privado. Las hemoglobinopatías pueden resultar en hallazgos hematológicos anormales y diversos, dependiendo de la mutaciones específicas presentes. El diagnóstico inicial se realiza con técnicas analíticas, como las técnicas electroforéticas, que caracterizan a la hemoglobina. El diagnóstico definitivo utiliza comúnmente técnicas como PCR, secuenciación de Sanger y amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples. Otras técnicas más especializadas son la secuenciación de segunda y tercera generación que se reservan para casos complejos donde los métodos convencionales no son suficientes. Debe tomarse en cuenta las ventajas y limitaciones específicas de cada técnica para escoger la más apropiada en cada caso. Los laboratorios nacionales presentan diferencias significativas entre los sectores público y privado en cuanto a las técnicas diagnósticas disponibles. En el sector público, se realiza principalmente el tamizaje de estas enfermedades mediante la electroforesis capilar de zona. En contraste, en el sector privado, pocos laboratorios realizan electroforesis in situ; algunos la envían a laboratorios externos, tanto nacionales como internacionales. Además, utilizan técnicas con más limitaciones lo que podrían resultar en la no detección de variantes de hemoglobina poco frecuentes. El diagnóstico molecular de hemoglobinopatías y talasemias es esencial para identificar parejas portadoras y realizar diagnósticos prenatales, lo que facilita un adecuado consejo genético. Estas técnicas permiten determinar con certeza los riesgos de transmitir estas enfermedades, proporcionando a las parejas la información necesaria para tomar decisiones informadas sobre la planificación familiar y reducir la incidencia de hijos gravemente afectados. Además, la implementación de estas técnicas en el tamizaje neonatal es crucial para confirmar casos sospechosos de síndromes drepanocíticos, asegurando una detección temprana y precisa que disminuya significativamente la morbilidad y mortalidad, mejorando con esto la calidad de vida de estos pacientes desde temprana edad.
Inmunitrombosis y Tromboinflamación
(2024-07-17) Díaz Venegas, David; Ugalde Solera, Danny
Existe un estrecho vínculo entre el sistema inmune innato, responsable de los procesos inflamatorios y la hemostasia, cuya forma aberrante se manifiesta a través de la trombosis. Se reconoce la evolución paralela de ambos sistemas al menos desde la aparición de los artrópodos y hasta la actualidad en los sistemas de mayor complejidad de los mamíferos. Desde que en el 2013 Engelman y Massberg definieran el término “inmunotrombosis”, reconociendo la formación de coágulos a partir de una respuesta inflamatoria, con la intención de facilitar el reconocimiento de patógenos y células dañadas, así como inhibir la proliferación de patógenos; han surgido una serie de conceptos relacionados, entre ellos “tromboinflamación”, que se define como la activación aberrante de la inmunotrombosis, originando cuadros trombóticos a partir de una respuesta inflamatoria descontrolada y a su vez la activación aberrante de la trombosis potencia la inflamación, generándose un círculo vicioso en la tromboinflamación. La inmunotrombosis y tromboinflamación se llevan a cabo mediante mecanismos celulares y moleculares, donde interactúan los componentes del sistema inmune innato (neutrófilos, monocitos, linfocitos, sistema del complemento, proteínas de fase aguda, citoquinas, quimiocinas) y el sistema hemostásico (endotelio, plaquetas, factores de la coagulación, sistema fibrinolítico). Múltiples patologías de diversa naturaleza son reconocidas en la actualidad por presentar mecanismos tromboinflamatorios, entre ellas: patologías con inflamación estéril (aterosclerosis, accidentes cerebrovasculares, tromboembolismo venoso), sepsis por microorganismos, enfermedades autoinmunes, enfermedades hematológicas, malignidad, enfermedades neurodegenerativas, entre muchas otras más. Además de terapia antiinflamatoria y anticoagulante clásica, actualmente se encuentra en distintas fases de investigación en ensayos clínicos, un amplio repertorio de opciones terapéuticas dirigidas contra componentes involucrados en la respuesta tromboinflamatoria de diferentes patologías. Estas nuevas opciones terapéuticas buscan ser más seguras, evitando las hemorragias usuales en las terapias clásicas y produciendo potentes efectos citoprotectores al contrarrestar los mecanismos inflamatorios, brindando beneficios clínicos en las personas
Modificadores de fenotipo en hemoglobinopatías y su correlación con la presentación clínica de la enfermedad
(2024) Quirós Miranda, María Alejandra; Rodríguez Romero, Walter
La Hb es una proteína tretramérica cuya principal función es el transporte de oxígeno a los tejidos. Las hemoglobinopatías son el conjunto de patologías hereditarias autosómicas recesivas provocadas por defectos en la molécula de hemoglobina. Los modificadores de fenotipo son elementos que alteran la expresión clínica de un gen; se categorizan en tres grandes grupos: primarios, secundarios y terciarios. Respecto a los modificadores primarios, en la beta talasemia el principal modificador es el tipo de mutación del gen beta que se hereda. En la α talasemia el genotipo y el tipo de mutación es el principal modulador primario. En la drepanocitosis son los haplotipos de la enfermedad. En cuanto los modificadores secundarios, en las beta talasemia inciden las mutaciones en los genes de las cadenas α, la concentración de HbF y los niveles de la proteína AHSP. En la alfa talasemia el principal modificador secundario es la coherencia de hemoglobina E. En la drepanocitosis influye los niveles de HbF y la herencia concomitante de otras hemoglobinopatías. Por último, respecto a los modificadores terciarios, en la beta talasemia estos involucran elementos como la presencia de polimorfismos que influyen sobre la densidad ósea, glucoronidación de la bilirrubina, apolipoproteínas, enzimas que actúan ante el estrés oxidativo, genes asociados con el metabolismo del hierro, así como la coherencia de enzimopatías. En las alfa talasemias los moduladores incluyen polimorfismos de nucleótido simple en los genes KL, BMP6 y anexina 2 y polimorfismos en genes relacionados con la glucoronidación de la bilirrubina. En la drepanocitosis los podemos subdividir en 4 categorías distintas: polimorfismos en genes relacionados con complicaciones de la enfermedad, coherencia de enzimopatías, infecciones y factores ambientales.
Perfiles moleculares y citogenéticos en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la leucemia mieloide aguda: Situación en Costa Rica
(2024-07-17) Zúñiga Carvajal, Priscilla; Granados Zamora, Melissa
La leucemia mieloide aguda es una enfermedad producida por una expansión clonal y un arresto en la diferenciación de las células progenitoras mieloides, que se caracteriza por ser genéticamente heterogénea. La incidencia aumenta con la edad, siendo más común en adultos mayores, aunque también puede afectar a niños. La patofisiología implica acumulación de mutaciones que confieren ventaja proliferativa y supervivencia a las células malignas, alterando la diferenciación hematopoyética normal. La clasificación de la Organización Mundial de la Salud del 2022, está basada en evidencia y funciona como estándar para el diagnóstico, investigación, registros de cáncer y vigilancia de salud pública en todo el mundo. Enfatiza la separación de LMA con anormalidades genéticas definidas de aquellas que no las tienen, eliminando el término LMA NOS y ajustando los criterios en los porcentajes de blastos requeridos para el diagnóstico. El diagnóstico de la LMA incluye hemograma, frotis de sangre periférica, panel bioquímico, pruebas de coagulación, citometría de flujo, análisis citogenéticos y moleculares. La caracterización genómica se ha vuelto cada vez más importante para el diagnóstico preciso, la evaluación de riesgos y la toma de decisiones terapéuticas en pacientes con leucemias agudas. La citogenética convencional sigue siendo vital en hematología, aunque requiere de cultivo celular y técnicas especializadas para su aplicación clínica, sigue aportando información valiosa en el diagnóstico y manejo de enfermedades hematológicas como la LMA. Cada técnica tiene ventajas y limitaciones específicas en términos de costo, tiempo de procesamiento, capacidad para detectar diferentes tipos de variantes genéticas y aplicaciones clínicas. La elección de la técnica adecuada depende de los objetivos y los recursos disponibles. En Costa Rica el procesamiento de las muestras para análisis moleculares y citogenéticos de los pacientes diagnosticados con LMA están a cargo del Laboratorio Clínico del Hospital Nacional de Niños, los análisis disponibles a la fecha son: cariotipo, FISH, PCR en tiempo real, PCR punto final y en casos excepcionales NGS.
Aplicaciones de la Citometría de Flujo en el diagnóstico y seguimiento de las Neoplasias Mielodisplásicas y su relación con pruebas moleculares
(2024) Saborío Navarro, Caterine; López Villegas, Jorge
Las neoplasias mielodisplásicas representan uno de los retos diagnósticos más complejos entre las neoplasias hematológicas. Debido a su alta variabilidad tanto en manifestaciones clínicas como en características inmunofenotípicas, citogenéticas y moleculares, es necesario un abordaje multi-modal que tome en cuenta la morfología y el estudio del inmunofenotipo por citometría de flujo como análisis simultáneos, y que funcionen de orientación para estudios posteriores de cariotipo y genética molecular, con el fin de brindar un diagnóstico integrado. La citometría de flujo constituye un papel muy importante en la caracterización inmunofenotípica de pacientes con neoplasias mielodisplásicas, principalmente cuando la displasia no logra ser evidente por medio de la morfología. En estas patologías se debe evaluar la presencia de displasia principalmente en cuatro compartimientos celulares: los progenitores mieloides, los granulocitos en maduración, los monocitos y la línea eritroide. Existen muchos sistemas de puntuación para mielodisplasia por citometría de flujo, sin embargo, el iFS se considera el sistema más completo a nivel mundial para el análisis por citometría de flujo de las neoplasias mielodisplásica al momento del diagnóstico. La mayoría de los pacientes con neoplasias mielodisplásicas presentan por lo menos una mutación genética asociada a estas patologías. Mutaciones que afectan genes que codifican para factores de splicing del ARN son las más frecuentes en estos pacientes. Se han descrito asociaciones entre ciertas características inmunofenotípicas con anormalidades genéticas específicas, como mutaciones en TET2, SF3B1, SRSF2 y la del(5q). Sin embargo, se considera necesario ampliar la investigación de esta relación inmunofenotipo-genotipo en las neoplasias mielodisplásicas, ya que hasta el momento el número de estudios con el que se cuenta es limitado. Las neoplasias mielodisplásicas en Costa Rica cuentan con una buena cobertura de estudios por citometría de flujo, sin embargo, el acceso a pruebas moleculares se considera muy restringido para estos pacientes.
Terapia génica y su uso en el tratamiento de enfermedades hematológicas: avances en hemofilia
(2024) Vargas Campos, Karol María; Ulloa Morales, Alejandro
La hemofilia es una enfermedad hereditaria ligada a X, que afecta alrededor de 247 146 personas en el mundo. Es causada por un defecto en los genes que codifican por el FVIII de la coagulación en el caso de la hemofilia A, y del FIX en el caso de la hemofilia B. Se caracteriza por una deficiencia cuantificada o funcional del factor afectado que resulta en eventos de sangrado prolongados posterior a una lesión, extracción dental o cirugía. En pacientes con deficiencia severa (<1% de actividad del factor) el sangrado lleva a artropatía, defectos neurocognitivos e incluso la muerte. En la actualidad el principal fin del tratamiento es corregir la deficiencia del factor a través de la administración de factor recombinante o concentrado plasmático. Sin embargo a partir de la década de los 1970s y su desarrollo posterior, la terapia génica surge como un tratamiento prometedor y de alto potencial para el tratamiento de esta patología e incluso su cura. Actualmente se encuentran en desarrollo alrededor de 14 ensayos clínicos en fase III, 15 en fase II y 8 en fase I que tienen como fin el desarrollo de nuevas terapias génicas en hemofilia. Para el 2024 se han aprobado 3 nuevas drogas utilizando esta tecnología. Este trabajo busca exponer las nuevas investigaciones y ensayos clínicos que se han realizado en temas de terapia génica en hemofilia, así como los fundamentos teóricos en los que se basan.
AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO DE LOS TRASTORNOS PLAQUETARIOS HEREDITARIOS; IMPLICACIONES CLÍNICAS Y TERAPÉUTICAS
(2024) Guido Martínez, Luis Alejandro
Cellular-level characterization of Dengue and Zika virus infection using multiagent simulation
(2018-09-13) Alvarado, Andreína; Corrales Barquero, Ricardo; Leal, María José; de la Ossa Osagueda, Álvaro; Mora Rodríguez, Rodrigo Mora; Arroyo Portilla, Manuel Francisco; Gómez Montero, Andrea; Calderón Castro, Alan; Arias Arias, Jorge Luis
In this paper we present a computational model aimed at characterizing the Zika viral infection at a cellular level based on measurements done on viral Dulbecco plaques over time, and describe our current state of progress in the modeling task. So far we have developed an agent-based simulation model of the dispersion of the virus on the cells conforming the viral plaque. The growth rate of the viral plaques and the number of cells counted on each plaque were used to characterize the viral infection in terms of parameters related to the fate of infected cells, such as the probability of a cell infecting its neighboring cells and the probability of an infected cell of dying at any given moment. The model can be used to predict viral plaque growth patterns similar to those observed in the laboratory. Our current efforts focus on optimizing the model parameters to fit the experimental data. Further development of the model includes the description of viral infection kinetics of specific viral strains. Our model has been developed using the agent-based modeling language Netlogo.
Re-emergence of Cochliomyia hominivorax in Costa Rica: Report of a human myiasis case 23 years after its elimination
(2024) Venegas Montero, Daniela Patricia; Alfaro Vellanero, María José; Rojas Araya, Diana; Calderón Arguedas, Ólger; Vargas Castro, Cinthya M.; Baldioceda Villarreal, Andrés; Chaves González, Luis Enrique; Camacho Leandro, Jacqueline; Troyo Rodríguez, Adriana
The New World screwworm, Cochliomyia hominivorax Coquerel (Diptera: Calliphoridae) was officially eliminated from Costa Rica in 2000, but it was reintroduced in 2023. A myiasis by C. hominivorax in a 71-year-old male with a four-month history of foot hyperkeratosis and interdigital ulcers is reported. The myiasis was detected before sampling for bacterial culture. Approximately 160 first and second-instar larvae were recovered and identified as C. hominivorax. Morphological identification was based mainly on characteristics of the cephalopharyngeal skeleton, spiracles, and pigmented dorsal tracheal trunks. Sequencing of a cytochrome c oxidase subunit I (MT-CO1) gene fragment confirmed the identity. The ulcers healed after extraction of the larvae and ciprofloxacin treatment for a concurrent Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa infection. Given the reintroduction of C. hominivorax in Costa Rica and the risk of northward expansion, this report highlights its impact on public health and calls for awareness among clinicians and healthcare practitioners.
The virus-induced cytopathic effect
(2023-12-31) Arias Arias, Jorge Luis; Céspedes Tenorio, Daniel
The cytopathic effect comprises the set of cellular alterations produced by a viral infection. It is of great relevance since it constitutes a direct marker of infection. Likewise, these alterations are often virus-specific which makes them a phenotypic marker for many viral species. All these characteristics have been used to complement the study of the dynamics of virus-cell interactions through the kinetic study of the progression of damage produced by the infection. Various approaches have been used to monitor the cytopathic effect, ranging from light microscopy, immunofluorescence assays, and direct labeling with fluorescent dyes, to plaque assay for the characterization of the infection over time. Here we address the relevance of the study of cytopathic effect and describe different experimental alternatives for its application.
Assessing target specificity of the small molecule inhibitor MARIMASTAT to snake venom toxins: a novel application of thermal proteome profiling
(2024) Smith, Cara F.; Modahl, Cassandra M.; Galindo, David Ceja; Larson, Keira Y.; Maroney, Sean P.; Bahrabadi, Lilyrose; Brandehoff, Nicklaus P.; Perry, Blair W.; McCabe, Maxwell C.; Petras, Daniel; Lomonte, Bruno; Calvete Chornet, Juan José; Castoe, Todd A.; Mackessy, Stephen P.; Hansen, Kirk C.; Saviola, Anthony J.
New treatments that circumvent the pitfalls of traditional antivenom therapies are critical to address the problem of snakebite globally. Numerous snake venom toxin inhibitors have shown promising cross-species neutralization of medically significant venom toxins in vivo and in vitro. The development of high-throughput approaches for the screening of such inhibitors could accelerate their identification, testing, and implementation and thus holds exciting potential for improving the treatments and outcomes of snakebite envenomation worldwide. Energetics-based proteomic approaches, including thermal proteome profiling and proteome integral solubility alteration (PISA) assays, represent “deep proteomics” methods for high throughput, proteome-wide identification of drug targets and ligands. In the following study, we apply thermal proteome profiling and PISA methods to characterize the interactions between venom toxin proteoforms in Crotalus atrox (Western Diamondback Rattlesnake) and the snake venom metalloprotease (SVMP) inhibitor marimastat. We investigate its venom proteome-wide effects and characterize its interactions with specific SVMP proteoforms, as well as its potential targeting of non-SVMP venom toxin families. We also compare the performance of PISA thermal window and soluble supernatant with insoluble precipitate using two inhibitor concentrations, providing the first demonstration of the utility of a sensitive high-throughput PISA-based approach to assess the direct targets of small molecule inhibitors for snake venom.
Ticks infesting humans in Central America: A review of their relevance in public health
(2023) Bermúdez Castillero, Sergio Eduardo; Lillian Domínguez A; Troyo Rodríguez, Adriana; Montenegro Hidalgo, Víctor Manuel; Triana Ortiz, Manuel Alfonso
Ticks are blood-sucking arthropods that parasitize most groups of terrestrial or semiaquatic vertebrates. Humans are accidental hosts to the ticks; however, in humans the ticks can cause damages varying from simple irritation to severe allergies, toxicosis, paralysis, and the transmission of pathogens, some of which can be fatal. Central America represents a narrow isthmus between North and South America and is considered a biodiversity hotspot. The importance of tick-borne diseases in this region is manifested by fatal outbreaks caused by Rickettsia rickettsii, severe and mild cases of other rickettsioses, ehrlichiosis, and tick-borne relapsing fevers, in addition to cases paralysis and strong allergic reactions. Even so, this information is scarce in most countries of this region, and there are no epidemiological data. In this article we present a review of the ticks that parasitize humans in Central America, covering data from the 19th Century to the present day. Of nearly 80 tick species reported in Central America, 28 species are reported on humans. This list includes species that thrive within homes, grazing areas and, to a lesser extent, in wild environments, both in lowland and high mountain forests. The most important genus in this region is Amblyomma, followed by Rhipicephalus and Ornithodoros, and to a lesser extent Haemaphysalis, Ixodes and Dermacentor. These data provide information on the tick species most commonly associated with humans in Central America, and highlight the potential for tick-borne diseases in wild, rural and urban regions.
Assessment of mathematical approaches for the estimation and comparison of efficiency in qPCR assays for a prokaryotic model
(2024) Molina Mora, José Arturo; Sibaja Amador, Meriyeins; Rivera Montero, Luis; Chacón Arguedas, Daniel; Guzmán Verri, Caterina; García Santamaría, Fernando
Quantitative PCR is a molecular technique for DNA quantification that depends on reaction efficiency and the Ct value (“cycle threshold”). However, the results are dependent on laboratory conditions and mathematical approaches. Thus, the data of 16 genes from Pseudomonas aeruginosa strain AG1 were generated using qPCR to assess the effect of DNA concentration and three mathematical methods (a standard curve and two individual-curve-based approaches called exponential and sigmoidal models) on efficiency and DNA quantification. Differences in efficiency were revealed depending on the mathematical method used; the values were 100% in three out of the four standard curves, but estimations of the expected fold change in DNA serial dilutions were not achieved, indicating the possible overestimation of efficiency. Moreover, when efficiency was compared to DNA concentration, a decreasing trend in efficiency as DNA concentration increased in the reaction was observed in most cases, which is probably related to PCR inhibitors. For all 16 genes at a single DNA concentration, the efficiencies for the exponential model were found in the range of 1.5–2.79 (50–79%), and for the sigmoidal approach, the range was 1.52–1.75 (52–75%), with similar impact on normalized expression values, as indicated by the genes for standard curves. Jointly, DNA concentration and mathematical model choice were demonstrated to impact the estimation of reaction efficiency and, subsequently, DNA quantification when using qPCR.
Exploring venom diversity in Mixcoatlus browni and Mixcoatlus barbouri: A comparative analysis of two rare Mexican snake species with crotoxin-like presence.
(2024-05-16) Neri Castro, Edgar; Zarzosa, Vanessa; Lomonte, Bruno; Zamudio, Fernando; Hernandez Orihuela, Lorena; Olvera Rodríguez, Alejandro; Rodríguez Solís, Audrey Michelle; Borja, Miguel; García Vázquez, Uri O.; Jones, Jason M.; Parkinson, Chistopher L.; Alagón, Alejandro
The genus Mixcoatlus is composed of three species: Mixcoatlus barbouri, M. browni, and M. melanurus, of which the venom composition of M. melanurus, the most common species of the three, has only recently been described. However, very little is known about the natural history of M. barbouri and M. browni, and the venom composition of these two species has remained thus far unexplored. In this study we characterize the proteomic profiles and the main biochemical and toxic activities of these two venoms. Proteomic data obtained by shotgun analysis of whole venom identified 12 protein families for M. barbouri, and 13 for M. browni. The latter venom was further characterized by using a quantitative 'venomics' protocol, which revealed that it is mainly composed of 51.1 % phospholipases A (PLA), 25.5 % snake venom serine proteases (SVSP), 4.6 % l-amino oxidases (LAO), and 3.6 % snake venom metalloproteases (SVMP), with lower percentages other six protein families. Both venoms contained homologs of the basic and acidic subunits of crotoxin. However, due to limitations in M. barbouri venom availability, we could only characterize the crotoxin-like protein of M. browni venom, which we have named Mixcoatlutoxin. It exhibited a lethal potency in mice like that described for classical rattlesnake crotoxins. These findings expand knowledge on the distribution of crotoxin-like heterodimeric proteins in viper snake species. Further investigation of the bioactivities of the venom of M. barbouri, on the other hand, remains necessary.
Proteomic analysis and lethality of the venom of Aegaeobuthus nigrocinctus, a scorpion of potential medical significance in the Middle East
(2024) Borges, Adolfo; Lomonte, Bruno
The scorpion Aegaeobuthus nigrocinctus inhabits areas in Turkey and the Levant region of the Middle East where severe/lethal envenomings have been reported. Previous research indicated its extreme venom lethality to vertebrates and distinct envenomation syndrome. We report on the composition of A. nigrocinctus venom from Lebanese specimens using nESI-MS/MS, MALDI-TOF MS, SDS-PAGE and RP-HPLC. Venom lethality in mice was also assessed (LD50 = 1.05 (0.19–1.91) mg/kg, i.p), confirming A. nigrocinctus venom toxicity from Levantine populations. Forty-seven peaks were resolved using RP-HPLC, 25 of which eluted between 20 and 40 % acetonitrile. In reducing SDS-PAGE, most predominant components were <10 kDa, with minor components at higher molecular masses of 19.6, 26.1, 46.3 and 57.7 kDa. MALDI-TOF venom fingerprinting detected 20 components within the 1,000–12,000 m/z range. Whole venom ‘shotgun’ bottom-up nLC-MS/MS approach, combined with in-gel tryptic digestion of SDS-PAGE bands, identified at least 67 different components belonging to 15 venom families, with ion channel-active components (K+ toxins (23); Na+ toxins (20); Cl− toxins (2)) being predominant. The sequence of a peptide (named α-KTx9.13) ortholog to Leiurus hebraeus putative α-KTx9.3 toxin was fully determined, which exhibited 81–96 % identity to other members of the α-KTx9 subfamily targeting Kv1.x and Ca2+-activated K+ channels. Chlorotoxin-like peptides were also identified. Our study underscores the medical significance of A. nigrocinctus in the region and reveals the potential value of its venom components as lead templates for biomedical applications. Future work should address whether available antivenoms in the Middle East are effective against A. nigrocinctus envenoming in the Levant area.
Efecto de distintas concentraciones de aditivos y condiciones de procesamiento en la germinación y crecimiento de esporas de Clostridioides difficile in vitro y en un modelo cárnico
(2024-04-12) González Vargas, Marcy; Redondo Solano, Mauricio
Clostridiodes difficile es uno de los principales agentes infecciosos causantes de la diarrea nosocomial, la cual se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad, además de altos costos en atención médica. Las esporas son la forma infectante de C. difficile y se transmiten por medio de la ruta fecal-oral. Diversos estudios en América del Norte y otras partes del mundo (incluyendo Costa Rica) han demostrado niveles importantes de contaminación de carne cruda con esta bacteria. Lo anterior podría representar un riesgo de contagio para el consumidor a nivel comunitario. Una problemática en los estudios de prevalencia son las diferentes técnicas utilizadas para el aislamiento de C. difficile y ningún estudio se ha dado a la tarea de realizar una evaluación sistemática de los factores que pueden afectar el crecimiento de este microorganismo en los medios de enriquecimiento. En este estudio se optimizó la concentración de taurocolato el cual es el componente más importante en la germinación de la espora de esta bacteria y cuya respuesta puede estar relacionada con la cepa involucrada. La dosis infectante de este microorganismo sigue siendo desconocida y su prevalencia es cada vez mayor y, tomando en cuenta que la ruta de infección es fecal- oral, este estudio determinó la capacidad de este microorganismo de crecer en un alimento procesado de origen cárnico, en el cual se utiliza materias primas que contienen este microorganismo. Para todos los estudios se utilizaron 3 cepas aisladas en Costa Rica de muestras clínicas y una cepa de referencia lo que permitió determinar si hay diferencias en su capacidad de germinar y crecer en cada una de las condiciones que se evaluaron en este trabajo. Las condiciones utilizadas fueron aquellas propias de los procesos productivos de embutidos a nivel nacional y de esta forma se pudo tener un panorama más claro de si esta bacteria podría ser un riesgo en productos de origen cárnico. Entre los principales resultados, al optimizar la cantidad de taurocolato y temperatura de activación para las cepas C30 y NAP7/RT078, se encontró que el modelo es significativo, para NAP1/RT027 el modelo no lo fue y para el VP1 10463 sí se presenta un modelo significativo y presenta significancia en los efectos cuadráticos por lo que el valor predicho de 0,7182 se puede alcanzar con varias combinaciones dentro del modelo. Al analizar el efecto de la adición de nitrito, sal, eritorbato y lactato, la combinación de los cuatro ingredientes cárnicos resultó en una inhibición significativa del crecimiento y para el caso del efecto de los ingredientes individuales, se reportó inhibición significativa para nitrito, lactato y sal en el caso de todas las cepas a excepción del aislado de referencia VPI/104693; para esta cepa de referencia se encontró una inhibición significativa solo en el caso del lactato. Al analizar efecto del tiempo de congelación previo en el crecimiento de esporas de C. difficile se observa que las cepas de los genotipos NAP1/RT027, NAP7/RT078 y C30 no presentan diferencia significativa en los diferentes tiempos de congelación y para el caso de la cepa de referencia VPI 10463 no se encontró un resultado lógico. En lo que respecta al tiempo de prerreducción del medio en el crecimiento de esporas de C. difficile todas las cepas crecieron aun cuando el medio no estaba prereducido (0 horas) y no se encontró diferencia significativa para los tiempos de 0 y 3 horas para ninguna de las cepas con excepción de la C30. Por último, se realizó un modelo secundario con la cepa del genotipo NAP1/RT027 con las tasas de crecimiento a diferentes concentraciones de nitritos se obtuvo una ecuación polinómica de segundo orden que mejor tuvo el ajuste y donde se puede observar una relación directamente proporcional (p < 0,05) entre la tasa de crecimiento y la concentración de nitrito (ppm). Todos los resultados indican que C. difficile es una bacteria que, no solo puede ser un patógeno de origen alimentario, sino que resiste condiciones típicas de la industria de cárnicos listos para consumir.
Desarrollo de un formulado biológico para controlar colonias de hormigas zompopas de la especie Atta cephalotes
(2024-02-27) Mesén Porras, Esteve Alonso; Pinto Tomás, Adrián A.
Las hormigas zompopas del género Atta son insectos eusociales prolíficos y dominantes en los ecosistemas terrestres de las regiones tropicales del continente americano. Debido a su estructura jerárquica en castas y su comportamiento polífago que genera defoliación masiva en cultivos para mantener su cultivar fúngico, conocido como jardín fúngico (JF), y crecer la densidad colonial, las zompopas son una plaga agrícola relevante en Centro y Sudamérica. Aunque se han creado programas de Manejo Integrado de Plagas para controlarlas, su manejo ha sido difícil porque los agroquímicos son ineficientes debido a los hábitos crípticos y comportamiento adaptativo de las hormigas para remover componentes peligrosos mediante mecanismos de inmunidad social y respuesta inmune innata. Para proporcionar una posible solución a este problema económico y sanitario, se desarrolló un formulado biológico que integró una mezcla de microorganismos antagonistas microencapsulados y un lipopolicomplejo conteniendo moléculas sustrato de ARN pequeño interferente funcional para la molécula Dicer (DsiRNA) para inhibir la respuesta de las hormigas de la especie A. cephalotes a la infección. Para optimizar el inóculo de los antagonistas microbianos, se realizaron cultivos duales y se seleccionó una mezcla compatible de 3 microorganismos compuesta por un parásito del jardín fúngico, Escovopsis sp. y dos patógenos de las hormigas, Bacillus thuringiensis y Metarhizium pinghaense. Luego, la mezcla microbiana se almacenó en microcápsulas de alginato (MCs) resistentes a temperatura y luz UV, mejorando su vida media en >6 semanas al adicionar pectina. Posteriormente se ejecutaron análisis transcriptómicos de enriquecimiento funcional para identificar genes que se sobre-expresan al enfrentar a las hormigas a patógenos, utilizando datos de acceso libre obtenidos con hormigas zompopas del género Acromyrmex expuestas a esporas de Metarhizium brunneum. Estos análisis permitieron seleccionar a la defensina-2 (Def) como gen-diana para ser silenciado con el fin de reducir la capacidad de las zompopas de combatir la infección generada por los microorganismos del formulado. Se diseñaron dos DsiRNA sintéticas basadas en Def para activar la vía siRNA, las cuales fueron atrapadas en nanopartículas (NPs) conteniendo un liposoma catiónico y alginato para potenciar su vida media. Se ejecutaron ensayos de laboratorio y campo con formulados que incluyeron MCs y NPs para determinar algunos parámetros tales como concentración media efectiva (EC50) y tiempo mediano de supervivencia (ST50) y evaluar la eficiencia del producto para colapsar el JF cultivado por las hormigas. Los resultados obtenidos fueron promisorios, puesto que el formulado logró colapsar el JF a nivel de laboratorio y reducir la expectativa de vida de las colonias en el campo. Sin embargo, se requiere alcanzar una mayor letalidad para que el producto sea efectivo en sistemas agrícolas, por ejemplo, aumentando la concentración microbiana adicionando más MCs o la cantidad de moléculas de ARNi. Por lo tanto, este trabajo representa un avance importante en la búsqueda de alternativas de bajo costo y amigables con el ambiente para el control de hormigas zompopas y otros insectos que constituyen plagas agrícolas en Costa Rica.
Identificación de regiones moleculares en metaloproteinasas hemorrágicas tipo PI y PIII de venenos de serpientes que interaccionan con proteínas de la membrana basal
(2024-05) Apú Leitón, Navilla Johanna; Herrera Arias, Cristina
Las metaloproteinasas de venenos de serpientes (MPVS) son enzimas dependientes de zinc presentes en los venenos de la familia Viperidae, que se caracterizan por provocar hemorragia local y sistémica. Se ha propuesto que la degradación de componentes de la membrana basal (MB) es un paso esencial en el mecanismo de hemorragia inducido por MPVS, ya que debilita la microvasculatura. Dentro de las proteínas de la MB involucradas se puede encontrar el colágeno IV y laminina, cuya degradación por parte de las MPVS se ha demostrado que posee un papel importante en el desarrollo de hemorragia. Sin embargo, aún no se conocen los exositios de las MPVS que podrían mediar la interacción con proteínas de la MB, y en cuales dominios de las MPVS podrían estar presentes estos exositios. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la interacción del colágeno IV y la laminina con metaloproteinasas hemorrágicas de venenos de serpientes tipo PI, PIII y el fragmento DC con el fin de identificar regiones moleculares que participan en esta interacción. Se demostró mediante ensayos in vitro que la CsH1, una MPVS de tipo PIII, es capaz de unirse al colágeno IV y la laminina, siendo esta interacción independiente de su actividad proteolítica pero dependiente de su estructura terciaria. En contraste, la BaP1, una MPVS tipo PI, mostró muy leve interacción con estas proteínas de la MB. En el caso del fragmento DC de la CsH1 no se observó interacción con el colágeno IV y la laminina en las condiciones estudiadas, lo que sugiere que esta interacción puede estar dada principalmente por el dominio metaloproteinasa. Además, se encontró que la unión previa del colágeno IV a la CsH1 o a la BaP1 reduce la actividad proteolítica y la capacidad de causar hemorragia de estas toxinas, indicando que el sitio de unión del colágeno a las MPVS es cercano a su sitio catalítico. Por otro lado, en ensayos ex vivo la CsH1 se distribuyó en la MB de los vasos sanguíneos, mientras que el fragmento DC se localiza de manera más difusa en el tejido, respaldando los resultados obtenidos en los ensayos de unión in vitro. Finalmente, los estudios de interacción mediante péptidos sintéticos derivados de regiones moleculares de la CsH1 y la BaP1 no arrojaron conclusiones definitivas, principalmente debido a limitaciones del diseño del estudio de docking y la falta de estructura tridimensional en los péptidos sintetizados. Estos resultados aportan nuevo conocimiento acerca de las regiones de las MPVS que interactúan con el colágeno IV y la laminina, así como las diferencias en la unión de las MPVS de tipo PI y PIII a estas proteínas.

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